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免疫共沉淀 簡介
  • 發(fā)布日期:2009-06-17      瀏覽次數(shù):2575
    • 蛋白質(zhì)間相互作用研究方法:免疫共沉淀
      1.用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
      2.將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量
      離心管中,在微量離心機(jī)上4℃以zui大速度離心15 min。
      3.收集上清(約30 ml)并加入30μg的適當(dāng)
      抗體,4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h。
      4.加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液,4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min。
      5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重復(fù)洗5次。zui后,用NETN洗一次。
      6.吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,煮沸4 min。
      7.將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中,在10 mA的恒定電流下電泳過夜。
      8.通過考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。
      9.從膠上切下目標(biāo)帶,將其放到微量
      離心管中,用1ml 50%乙腈洗兩次,每次3 min。
      10. 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì),再將肽電洗脫。
      11. 通過窄孔
      液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測(cè)序

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