在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
（一）酶標記抗體的滴定方法：將抗原（或抗體）物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標抗體（或抗Ig抗體）與吸附在載體上的抗原（或抗體）起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
（二）步驟：先將抗原（或抗體）用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600（根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定），分別加入反應(yīng)孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO4 0.05ml終止反應(yīng)。
（三） 結(jié)果判定：主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值，并以O(shè)D為縱座標，結(jié)合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。
注意事項
1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高、效價高（zui低1:16）、純度高、親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，（或必需）新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體（雜質(zhì)）。否則，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. 濃的標記物相當穩(wěn)定，常加入30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年，但稀釋成1:10，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12小時內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。
